实验八 蛋白免疫印迹法
【实验目的】
1．掌握电转印的基本原理。
2．掌握半干式石墨电转印槽的使用方法。
3．掌握免疫印迹检测的基本原理。
【实验原理】
为了检测样品中是否存在待测蛋白质，或者想了解目的蛋白质的修饰状态等，需要将SDS-PAGE电泳后的凝胶中的蛋白质转移到固相支持物上(即电转印)，然后用蛋白特异性的抗体和显色剂进行检测(即蛋白免疫印迹Western Blot法)。电转印的原理是通过蛋白质在电场作用下由负极向正极迁移的原理，通过给予一定的pH值环境和电场作用，将凝胶中的蛋白质转移到能与蛋白质疏水结合的固相支持物滤膜上。电转印所需固相支持物包括硝酸纤维滤膜、PVDF膜和阳离子尼龙膜等。各种膜对蛋白质的结合效率稍有差异，机械强度也不尽相同，可根据试验要求进行选择。最常用的滤膜是孔径为0．45μm的硝酸纤维滤膜和PVDF膜。电转印的效率可以通过常规蛋白染色的方法(如考马斯亮蓝染色等)加以确认。
蛋白质转印到滤膜上之后，在进行抗体杂交之前，需要先对承载蛋白质的滤膜进行封闭，以防止免疫试剂对滤膜的非特异性吸附造成的背景着色。常用封闭溶液采用含5%脱脂奶粉的TBS或5% BSA-TBS。随后用针对目的蛋白质的特异性抗体(单克隆或多克隆抗体)与滤膜进行孵育反应，随后用酶标的二抗进行放大和耦联反应，采用针对二抗上标记的呈色剂或发光剂即可通过分析着色位置和强度检测出特定蛋白质表达情况的信息。
【实验器材】
半干式石墨电转仪、电源、剥胶器或刀片、10 ml注射器、NC膜、Whatman 6号滤纸、玻璃平皿1个、玻璃量筒、烧杯、玻璃吸管若干。
【药品试剂】
1．TBS:10 mmol/L Tris，0．9%NaCl，用1 mol/L HC1调pH值至7．4。
2．含5%脱脂奶粉的TBS缓冲液。
3．含0．1%Tween20 TBS缓冲液。
4．电转缓冲液:39 mmol/L Glycine(2．9 g/L)、48 mmol/L Tris(5．8 g/L)、0．037%SDS(0．37g/L)、20%甲醇(200 ml/L)。
5．显色液:沉淀型单组分TMB底物溶液。TMB:3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-tetramethylbenzidine)(DAB底物更为常用，但有毒)。
【实验方法】
1．将PVDF膜和What man 6号滤纸切出与凝胶一样大小，置于转移缓冲液中湿润5～10分钟。
2．SDS-PAGE结束后，戴手套用剥胶器或刀片小心分开两玻璃板，将上部的浓缩胶部分划开弃去，取10 ml注射器吸取转印液，插入玻璃板与凝胶之间注入，使水的压力将两者自然分开，边推边进，反复多次注水，直至凝胶从玻璃板上滑落下来，置于转移缓冲液中。
3．用少量转移缓冲液润湿半干式石墨电转板，然后按三层滤纸、PVDF膜、凝胶、三层滤纸的顺序从下至上依次放置于半干式石墨电转板上。注意每层之间避免气泡，边缘尽量对齐。注意不要放反了，此时蛋白质带有负电荷，在电压作用下向正极转移，因此PVDF膜要放在靠近正极的方向。
4．加上阳极电极板，接通电源，110 V稳压转印30分钟(转印时间具体由待测蛋白质的大小决定，对于高分子量的蛋白质应适当延长转印时间)。
5．转印时配制含5%脱脂奶粉的封闭液20 ml。
6．转印完毕后，将承载蛋白质的滤膜取出，放在封闭液中，轻摇封闭30分钟以上。此时用封闭液配制1∶1000的一抗羊抗鼠β-actin抗体10 ml。
7．弃去封闭液，加入稀释后的一抗，室温轻摇1小时。
8．回收一抗，用含0．1%Tween的TBS洗膜，每5分钟换一次TTBS，共三次。此时用TBS配制1∶1000的HRP标记的兔抗羊IgG抗体10 ml。
9．弃去洗涤液，加入稀释后的二抗，室温轻摇40～60分钟。
10．回收一抗，用含0．1%Tween的TBS洗膜，每5分钟换一次TTBS，共三次。最后用TBS洗膜一次。
11．加入沉淀型单组分TMB底物溶液2 ml，边摇边观察蓝紫色实验条带;待条带清晰且背景干净时，迅速弃去底物溶液，流水冲洗滤膜以中止反应。
12．干燥滤膜，照相。
【思考题】
1．简述免疫蛋白印迹法的注意事项。
2．Western Blot检测底物的方法有哪些，如何进行选择?
